Center for Indonesian Veterinary Analytical Studies
Friday, 28 April 2017

Trypanosomiasis (Surra)

Selasa, 25 Februari 2014

IV. Identifikasi Penyakit

Gejala Klinis

Gejala klinis yang tampak pada hewan bervariasi tergantung pada keganasan/virulensi agen T. evansi, jenis hewan (host) yang terinfeksi dan faktor lain yang dapat menimbulkan stress. Lama waktu antara awal infeksi dan munculnya gejala klinis (masa inkubasi) bervariasi, rata – rata 5 sampai 60 hari pada infeksi akut. Akan tetapi penyakit Surra umumnya berlangsung kronis (chronic infection) dengan angka kematian yang rendah sehingga pernah dilaporkan masa inkubasi yang lebih lama yaitu 3 bulan. Setelah masa inkubasi, dalam waktu kurang dari 14 hari akan ditemukan parasit yang beredar dalam sirkulasi darah (parasitemia).

Manisfestasi klinis penyakit Surra dapat berupa gejala demam berulang (intermiten) akibat parasitaemia. Parasitemia sangat tinggi variasinya selama masa infeksi: tinggi pada awal infeksi, rendah selama infeksi berjalan kronis dan hampir tidak ada pada hewan pembawa agen (carrier).

Anemia merupakan gejala yang paling banyak ditemukan pada infeksi oleh trypanosoma. Membran sel darah merah akan kehilangan salah satu komponen penyusun yaitu asam sialik (sialic acid). Hal tersebut akan mengaktifkan makrofag pada organ limpa, hati, paru-paru, limfonodus dan sum-sum tulang untuk memfagosit sel darah merah sehingga menyebabkan penurunan jumlah sel darah merah.

Gejala lain diantaranya penurunan berat badan, pembengkakan limfonodus prescapularis kiri dan kanan, kelemahan otot tubuh, oedema pada anggota tubuh bagian bawah seperti kaki dan abdomen, urtikaria pada kulit, perdarahan titik (petechial haemorrhages) pada membran serous kelopak mata, hidung dan anus, keguguran (abortus), dan gangguan syaraf. Penurunan imunitas tubuh (imunosupresi) juga ditemui sehingga hewan inang menjadi rentan terhadap infeksi sekunder.

Patologi Anatomi

Pada pemeriksaan pasca hewan mati (post-mortem examination), perubahan patologi anatomi yang ditemukan umumnya tidak spesifik. Pada hewan yang mati dapat diamati kondisi kekurusan (emaciation), perdarahan titik (petechial haemorrhages) pada beberapa organ internal, penumpukan cairan abnormal baik pada rongga dada (hydrothorax) maupun pada rongga perut (ascites), kelenjar pertahanan/limfonodus dan organ limpa tampak lebih besar daripada ukuran normal (lymphadenopathy dan splenomegaly).

Pengujian Laboratorium

Dikarenakan gejala klinis infeksi T. evansi tidak bersifat khas (patognomonis), maka pemeriksaan gejala klinis sebaiknya juga ditunjang dengan pengujian di laboratorium untuk konfirmasi agen penyebab. Uji parasit, uji serologi dan uji molekuler merupakan teknik pengujian yang digunakan untuk diagnosis konfirmatif di laboratorium.

Uji parasit diantaranya pemeriksaan haematologi (mikroskopik), microhematocrit centrifugation technique (MHCT) dan mouse inoculation test (MIT). Uji serologi dapat dilakukan dengan metode card agglutination test for trypanosomes (CATT) dan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), sedangkan uji molekuler menggunakan polymerase chain reaction (PCR).

Pemeriksaan haematologi dengan teknik ulas darah tipis terkadang mengalami hambatan karena agen T. evansi hanya dapat dideteksi pada saat terjadi parasitemia yang tinggi. Sedangkan pada kasus infeksi yang berjalan kronis, diperlukan pemeriksaan ulas darah tebal, MHCT dan MIT.

Untuk kepentingan diagnostik terhadap trypanosomiasis, pengujian dengan teknik CATT memiliki sensitifitas lebih tinggi dibandingkan teknik MIT dan MHCT. Disamping itu, teknik CATT dapat digunakan untuk melakukan uji tapis (screening test) dan kemudian dapat dilanjutkan dengan uji PCR untuk konfirmasi agen T. evansi.

Pengambilan dan Pengiriman Sampel

Untuk keperluan pengujian laboratorium, sampel yang dapat diambil antara lain sampel darah utuh (dengan heparin atau EDTA), ulas darah, serum, sampel jaringan (misalnya otak, jantung, paru-paru, limpa, sum-sum tulang) yang difiksasi dalam formalin.

Sampel darah diperoleh dari pembuluh vena perifer antara lain vena pada bagian telinga atau ekor. Pengambilan sampel darah sebaiknya dilakukan pada saat hewan mengalami demam dimana pada saat itu terjadi parasitemia tinggi di dalam sirkulasi darah. Sedangkan untuk pemeriksaan serologis, sampel darah dapat diambil dari pembuluh vena besar seperti vena pada daerah leher (vena jugularis).

Sebelum pengambilan sampel darah, dipastikan dulu bahwa ujung jarum suntik telah disterilkan dengan alkohol. Pengambilan darah disarankan menggunakan satu suntikan (syringe) atau satu tabung koleksi darah (blood collection tube) untuk satu ekor hewan untuk mencegah penularan silang.

Sampel darah utuh dan sampel serum harus disimpan pada suhu dingin (4oC) di dalam wadah yang tertutup rapat dan terlindung dari cahaya dan pada saat pengiriman jangan dibekukan (frozen). Parasit T. evansi dapat bertahan selama 48 jam di dalam sampel darah pada suhu dingin (refrigerated blood) selama 48 jam (Reid et al., 2001). Preparat ulas darah dapat disimpan pada suhu ruang di dalam wadah kantong plastik. Dalam hal pengiriman, semua sampel harus menggunakan wadah yang tidak bocor (leakproof containers) dan tetap menggunakan prinsip rantai dingin (cold chain). Setiap sampel yang dikirimkan ke laboratorium harus disertai dengan keterangan yang memadai.

Uji yang Dilakukan

Ketersediaan laboratorium diagnostik mutlak diperlukan karena sangat membantu mendeteksi hewan terinfeksi, baik yang menunjukkan gejala klinis maupun pada infeksi subklinis atau kronis dimana gejala klinis sulit diamati.

Uji Parasit

Uji ini sangat bergantung pada jumlah parasit trypanosoma yang beredar dalam sirkulasi darah. Dengan demikian, teknik ini paling baik digunakan pada infeksi akut saat terjadi parasitemia tinggi.

Preparat Darah Segar. Satu tetes darah diletakkan pada gelas objek. Kemudian ditempelkan gelas penutup (cover glass) sehingga darah akan tersebar merata pada gelas objek. Pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya (200x) untuk melihat pergerakan (motilitas) trypanosoma yang masih hidup.

Preparat Ulas Darah Tebal.

Dilakukan dengan cara meletakkan tetesan darah (dua atau tiga tetes) pada gelas objek, kemudian dioleskan dengan menggunakan tusuk gigi atau gelas objek yang lain sehingga terbentuk luasan 1,0 – 1,25 cm2. Preparat dikeringkan pada suhu ruang selama minimal satu jam. Selanjutnya preparat diwarnai dengan Giemsa selama 25 menit. Setelah dicuci dengan aquades, pengamatan dapat dilakukan menggunakan mikrokop cahaya (500–1000x). Kelebihan dari preparat ulas darah tebal adalah bahwa teknik ini dapat membuat endapan darah pada area yang kecil sehingga waktu yang diperlukan untuk mendeteksi parasit menjadi lebih singkat. Adapun kelemahan teknik ini adalah bahwa agen T. evansi dapat menjadi rusak selama proses pengerjaan preparat sehingga teknik ini tidak direkomendasikan untuk identifikasi spesies trypanosoma pada kasus infeksi campuran (mixed infections).

Preparat Ulas Darah Tipis.

Sebanyak satu tetes darah diletakkan pada gelas objek kemudian diulas/digesekkan dengan ujung gelas objek yang lain. Preparat kemudian difiksasi dengan methanol (methyl alcohol) selama dua menit, dikeringkan dan diwarnai dengan Giemsa selama 25 menit. Preparat dicuci, dikeringkan dan diwarnai dengan pewarna May–Grünwald selama 2 menit. Kemudian ditambahkan PBS (pH 7,2) dan dibiarkan selama 3 menit. Setelah itu dilarutkan dalam pewarna Giemsa selama 25 menit, preparat dicuci dan akhirnya dikeringkan. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop cahaya (400–1000x) untuk melihat morfologi secara detail dan untuk kepentingan identifikasi spesies trypanosoma. Sebagai alternatif, pewarnaan preparat dapat dilakukan dengan menggunakan pewarnaan cepat (rapid staining techniques).

Biopsi Limfonodus.

Sampel biopsi diambil dari limfonodus prescapularis atau precruralis (subiliacus). Sampel biopsi limfonodus diletakkan pada gelas objek, ditutup dengan cover glass dan diamati dengan mikroskopik.

Metode Endapan (Concentration methods). Pada beberapa hewan, infeksi T. evansi dapat berlangsung subklinis yang ditandai dengan parasitemia yang rendah. Kondisi ini menyebabkan tidak mudah untuk menemukan agen parasit T. evansi di dalam sirkulasi darah sehingga diperlukan metode endapan. Teknik yang digunakan adalah sentrifugasi hematokrit, endapan fase kontras, dan hemolisis sel darah merah.

Teknik sentrifugasi hematokrit (haematocrit centrifugation test / HCT) ; sampel darah diambil menggunakan minimal dua tabung kapiler berheparin. Ujung salah satu tabung ditutup/disegel, kemudian disentrifugasi dimana posisi ujung tabung yang disegel berada di bawah. Pada tabung kapiler akan terbentuk endapan sel darah putih (buffy coat). Pada permukaan tabung diteteskan minyak emersi sehingga kapiler kontak dengan lensa objektif mikroskop (100–200x). Teknik sentrifugasi hematokrit tergolong sederhana dan merupakan uji cepat (rapid test) yang dapat dilakukan di lapangan.

Teknik endapan fase kontras (phase-contrast buffy coat technique) ; sampel darah diambil menggunakan tabung kapiler berheparin dan disentrifugasi sebagaimana pada metode sentrifugasi hematokrit. Pada tabung kapiler akan terbentuk tiga lapisan (endapan sel darah merah, sel darah putih/buffy coat, dan plasma). Tabung kapiler dipotong sekitar 1 mm di bawah lapisan buffy coat. Secara perlahan buffy coat dikeluarkan, diletakkan di atas gelas objek, ditutup dengan cover glass dan diamati pada mikroskop dengan latar yang gelap atau fase kontras.

Teknik hemolisis sel darah merah (haemolysis techniques) ; digunakan sodium dodecyl sulphate (SDS) sebagai reagen untuk menghancurkan/melisiskan sel darah merah sehingga trypanosoma dapat dideteksi pada sampel darah. Larutan SDS tergolong bahan beracun sehingga pengerjaan dengan bahan ini harus berhati-hati. Baik larutan SDS maupun sampel darah sebaiknya digunakan pada suhu di atas 15°C karena pada suhu yang lebih rendah dapat terjadi kerusakan trypansoma dalam sampel darah.

Inokulasi pada Hewan Percobaan (Mouse Inoculation Test / MIT)

Hewan percobaan digunakan untuk mendeteksi T. evansi pada infeksi subklinis. Rodensia seperti tikus dan mencit digunakan untuk inokulasi. Walaupun tidak mencapai 100%, namun sensitifitas pengujian ini dapat ditingkatkan dengan penggunaan hewan percobaan yang imunitasnya lemah.

Inokulasi sampel darah berheparin dilakukan secara intraperitonial pada tikus (1–2 ml) atau mencit (0.25–0.5 ml). Inokulasi dilakukan pada minimal dua ekor hewan. Setelah diinokulasi, hewan percobaan diambil darahnya tiga kali seminggu untuk mendeteksi parasitemia.

Pemeriksaan Haematologi

Kondisi anemia merupakan salah satu gejala yang berkaitan dengan infeksi trypanosoma walaupun bukan gejala yang khas (patognomomis). Pada hewan yang mengalami infeksi subklinis misalnya, dapat terjadi parasitemia tanpa ditemukan gejala anemia.

Anemia pada hewan terinfeksi T. evansi dapat diketahui dengan menghitung volume sel darah (packed cell volume). Teknik ini dapat digunakan untuk pengamatan/surveilans penyakit Surra dengan basis populasi. Prosedur pengujian sama dengan prosedur pada sentrifugasi hematokrit . Sampel darah pada tabung kapiler diamati dan hasil uji dipresentasikan dalam bentuk persentase sel darah merah terhadap volume total darah.

Uji Serologis

Metode yang digunakan untuk mendeteksi antibodi humoral spesifik terhadap antigen T. evansi antara lain card agglutination tests (CATT), enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), dan latex agglutination tests. Sensitifitas uji serologis lebih tinggi daripada uji parasit, namun diperlukan standarisasi terutama berkaitan dengan interpretasi hasil dan prosedur pengujian di laboratorium.

Card agglutination tests (CATT)

Telah diketahui bahwa trypanosoma mampu menampilkan berbagai variasi antigen permukaan (variable antigen types / VAT). Hal ini menjadi dasar untuk pengujian dengan metode card agglutination test (CATT). Metode CATT menggunakan VAT trypanosoma yang dikenal sebagai RoTat 1.2. Antigen permukaan, baik yang dapat berubah bentuk (variable) maupun yang tidak (invariable), berperan dalam reaksi aglutinasi. Hasil uji akan tampak berupa reaksi aglutinasi dimana granul berwarna biru akan terlihat sebagai tanda positif reaksi.

Metode CATT terutama digunakan untuk pengujian serologis dengan basis populasi, bukan individual. Metode CATT dapat digunakan untuk pengujian serologis pada fase infeksi subklinis atau kronis.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Sensitifitas metode ELISA diketahui lebih baik daripada metode CATT. Pada pengujian ELISA dengan basis individual, diperlukan kehati-hatian saat melakukan interpretasi hasil uji dan lebih baik jika ditunjang dengan uji parasit. Metode ELISA sangat bermanfaat untuk surveilans/pengamatan pada populasi hewan yang besar.

Teknik ELISA bekerja dengan cara mendeteksi antibodi spesifik terhadap trypanosoma . Hal ini dapat dilakukan melalui reaksi antara enzim bertaut anti immunoglobulin (enzyme-linked anti-immunoglobulins) dan antigen terlarut pada ELISA plate. Enzim yang digunakan antara lain peroxidase, alkaline phosphatase atau enzim lain yang sesuai. Konjugat enzim akan berikatan dengan kompleks antigen-antibodi dan kemudian bereaksi dengan substrat sehingga menghasilkan perubahan warna. Perubahan warna tersebut terjadi akibat adanya ikatan dengan substrat atau karena penambahan indikator (chromogen). Antigen yang digunakan untuk melapisi ELISA plates diperoleh dari darah tikus yang mengalami parasitemia tinggi.

Latex agglutination tests

Pengujian dilakukan dengan mereaksikan partikel lateks yang dilapisi antigen T. evansi RoTat 1.2 (antigen-coated latex particles) dan sampel serum darah hewan inang pada test card. Perubahan pada test card dapat diamati di akhir waktu inkubasi. Reaksi aglutinasi terhadap partikel lateks akan tampak pada sampel serum darah yang mengandung agen T. evansi.

Uji Molekuler

Metode polymerase chain reaction (PCR) digunakan untuk mendeteksi agen T. evansi di dalam darah host yang terinfeksi dan dalam darah (blood meal) pada lalat Tabanus. Teknik PCR memiliki sensitifitas uji yang hampir sama dengan teknik inokulasi pada hewan percobaan (MIT). Hasil uji PCR negatif palsu (false negative) dapat terjadi pada kondisi parasitemia yang sangat rendah misalnya pada infeksi kronis.

Diagnosa Banding

Trypanosomiasis (Surra) pada sapi dan kerbau dapat dikelirukan dengan gejala penyakit lain seperti babesiosis, anaplasmosis, theileriosis, perdarahan sepsis, anthraks, penyakit parasit kronis dan malnutrisi. Pada kuda, trypanosomiasis memiliki gejala yang mirip dengan African horse sickness, equine viral arteritis, anemia infeksius, penyakit parasit kronis, dan dourine. Trypanosomiasis yang ditularkan oleh lalat tse-tse, anthraks, dan penyakit parasit kronis merupakan diagnosis banding Surra pada unta. Sedangkan pada anjing dan kucing, gejala penyakit Surra dapat dibandingkan dengan infeksi haemobartonella dan rabies.